在類器官培養(yǎng)過程中，傳代是維持其長期穩(wěn)定擴(kuò)增與功能活性的核心環(huán)節(jié)，而傳代效率的高低直接取決于關(guān)鍵步驟的精準(zhǔn)把控。以下將從操作手法標(biāo)準(zhǔn)化、類器官自身因素影響、營養(yǎng)體系優(yōu)化三大維度，詳細(xì)拆解類器官傳代的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)，為科研人員提供可落地的實(shí)踐指南。

一、操作手法標(biāo)準(zhǔn)化：以 “流程優(yōu)化 - 參數(shù)量化 - 問題解決" 為核心

類器官傳代的操作手法標(biāo)準(zhǔn)化是降低批次差異、提升可重復(fù)性的關(guān)鍵，需圍繞基質(zhì)膠冷化、離心條件、消化控制、吹打技巧及分層問題處理五大環(huán)節(jié)，建立精準(zhǔn)的參數(shù)體系與動(dòng)態(tài)決策方案。

1. 基質(zhì)膠冷化：按敏感性匹配溫度 - 時(shí)長組合

基質(zhì)膠的冷化處理需根據(jù)類器官對溫度和時(shí)長的敏感性差異調(diào)整策略，避免因冷化不當(dāng)影響后續(xù)分離效率與細(xì)胞活性：

• 溫度敏感型類器官（如部分神經(jīng)類器官）：推薦 4℃或 0℃預(yù)冷 30 分鐘，既能保證基質(zhì)膠充分軟化，又可避免低溫對細(xì)胞的損傷；

• 時(shí)長敏感型類器官（如快速增殖的腫瘤類器官）：建議 - 20℃預(yù)冷 5 分鐘，縮短操作周期以減少細(xì)胞暴露在不適環(huán)境中的時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)表明，0℃預(yù)冷可作為 4℃的替代方案，在維持類器官活性的同時(shí)，兼容部分對低溫耐受性略高的類型。需特別注意，冷化過程中溫度波動(dòng)需控制在 ±1℃范圍內(nèi)，否則會(huì)影響基質(zhì)膠的黏度一致性，進(jìn)而干擾后續(xù)傳代操作。

2. 離心條件：低溫與水平角離心協(xié)同提升效果

離心環(huán)節(jié)的核心目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)基質(zhì)膠與類器官的分層，同時(shí)保留細(xì)胞活性，關(guān)鍵參數(shù)與設(shè)備選擇如下：

• 核心參數(shù)：4℃低溫環(huán)境、200-300g 轉(zhuǎn)速、5 分鐘以內(nèi)離心時(shí)長；

• 離心機(jī)選擇：優(yōu)先使用水平角離心機(jī)，其在離心過程中可使樣本液柱與離心管保持平行，讓基質(zhì)膠與類器官沉淀分層更好，相比固定角離心機(jī)，基質(zhì)膠殘留率可降低 25%，減少后續(xù)消化步驟的干擾；

• 類型適配調(diào)整：體積較大的類器官（如肝類器官）建議采用 300g 離心 5 分鐘，而鼠源類器官可適當(dāng)降低至 200g，避免因離心力過大造成機(jī)械損傷。

3. 消化控制：室溫鏡檢精準(zhǔn)判斷終點(diǎn)

消化是解離類器官結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟，需通過溫度控制與鏡檢觀察，平衡解離效率與細(xì)胞活性：

• 操作環(huán)境與時(shí)長：全程在室溫超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，消化時(shí)長嚴(yán)格控制在 2-3 分鐘，避免高溫（如 37℃）導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高（室溫操作可使凋亡率降低 15%），尤其適用于胃腸道、食管等對酶解敏感的類器官；

• 終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)：通過顯微鏡觀察細(xì)胞團(tuán)直徑，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)達(dá)到 50-100μm 時(shí)，立即終止消化；

• 酶試劑選擇：需匹配類器官組織類型，例如肝類器官推薦使用 TrypLE™ Express 酶室溫孵育 5-10 分鐘，腸類器官則優(yōu)先采用 Dispase 或?qū)Ｓ孟?nbsp;D，防止因過度酶解導(dǎo)致單細(xì)胞化，進(jìn)而降低細(xì)胞活性。

4. 吹打技巧：低剪切力實(shí)現(xiàn)高效分散

吹打操作的核心是在分散細(xì)胞團(tuán)的同時(shí)，減少機(jī)械剪切力對細(xì)胞的損傷，具體技巧如下：

• 工具選擇：采用 1mL 槍頭或無菌巴氏吸管，避免使用 200μL 槍頭（后者易導(dǎo)致 12% 的細(xì)胞碎裂率，而 1mL 槍頭可將碎裂率控制在 5% 以下）；

• 操作手法：以輕柔的圓周運(yùn)動(dòng)吹打，吹打次數(shù)控制在 30 次以內(nèi)，全程避免產(chǎn)生氣泡（氣泡會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)）；

• 類型適配調(diào)整：囊性類器官建議使用火焰拋光的玻璃巴氏吸管進(jìn)行機(jī)械剪切，密集型類器官可結(jié)合 TrypLE Express 酶解后再行吹打，實(shí)現(xiàn) “酶解 + 機(jī)械分散" 的協(xié)同優(yōu)化。

5. 問題解決：離心分層的動(dòng)態(tài)決策

離心后常見分層結(jié)構(gòu)為 “緩沖液（上層）- 基質(zhì)膠（中層）- 類器官沉淀（下層）"，需根據(jù)類器官數(shù)量動(dòng)態(tài)調(diào)整保留策略，避免因處理不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞損失：

• 數(shù)量極少情況（如原代培養(yǎng)或低代數(shù)傳代）：保留沉淀層 + 基質(zhì)膠下 2/3，點(diǎn)膠時(shí)新膠量需為殘留膠的 1.5 倍以上，彌補(bǔ)細(xì)胞數(shù)量不足的問題；

• 數(shù)量中等情況：保留沉淀層 + 基質(zhì)膠全層，同時(shí)增加離心轉(zhuǎn)速至 300g，減少基質(zhì)膠對后續(xù)培養(yǎng)的干擾；

• 分層模糊情況：加入 1mL 預(yù)冷緩沖液 G 重懸后，4℃靜置 10 分鐘，利用密度差異實(shí)現(xiàn)二次分離，提升分層清晰度。

操作要點(diǎn)速覽

通過上述標(biāo)準(zhǔn)化操作，可使類器官傳代效率提升 30%，批次間變異系數(shù)從 22% 降至 8%，為長期培養(yǎng)與藥物篩選提供穩(wěn)定技術(shù)支撐。

二、類器官自身因素影響：從活性、數(shù)量、結(jié)構(gòu)把控傳代基礎(chǔ)

類器官自身的生物學(xué)特性是決定傳代效率的內(nèi)在因素，需從活性強(qiáng)度、數(shù)量閾值、結(jié)構(gòu)完整性三個(gè)維度進(jìn)行評估與調(diào)控，確保傳代過程的可持續(xù)性。

1. 活性強(qiáng)度：傳代能力的核心決定因素

不同類型類器官的活性強(qiáng)度差異顯著，直接影響其傳代潛力，可根據(jù)傳代難度分為 “易傳代" 與 “難傳代" 兩類：

• 易傳代類器官：以腸癌、子宮內(nèi)膜癌類器官為代表，其干性維持能力強(qiáng)，連續(xù)傳代可達(dá) 30 代以上；鼻類器官更具特殊性，可通過自發(fā)支持病毒復(fù)制實(shí)現(xiàn)無需外源性因子的連續(xù)傳代；

• 難傳代類器官：包括肝癌、前列腺癌、甲狀腺癌類器官，傳代后常因干性耗竭出現(xiàn)生長停滯甚至凋亡；氣道類器官則需抑制干擾素通路（如使用 CYT387），才能克服免疫反應(yīng)導(dǎo)致的傳代障礙。

類器官的活性強(qiáng)度與干細(xì)胞微環(huán)境信號(hào)密切相關(guān)，例如腦腫瘤干細(xì)胞類器官需持續(xù)補(bǔ)充 Wnt3a 與 RSPO1 信號(hào)分子，若缺失此類干性維持因子，傳代后細(xì)胞會(huì)迅速分化并喪失增殖活性。

2. 數(shù)量閾值：密度依賴性增殖的臨界調(diào)控

類器官傳代需滿足 “數(shù)量閾值"，即單位培養(yǎng)空間內(nèi)達(dá)到足夠數(shù)量的功能性細(xì)胞團(tuán)，以保障旁分泌信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的完整性，避免陷入 “增殖停滯陷阱"：

• 臨界數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)：24 孔板培養(yǎng)體系中，每孔類器官數(shù)量需≥20 個(gè)；若低于此閾值（如每孔僅 5-15 個(gè)），細(xì)胞團(tuán)分泌的生長因子（如 EGF、FGF）濃度不足，會(huì)導(dǎo)致增殖效率大幅下降；

• 密度適配調(diào)整：鋪板密度需嚴(yán)格控制，過高（>150 個(gè) / 孔）會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)競爭加劇，培養(yǎng)基 24 小時(shí)內(nèi)即變黃，代謝廢物積累抑制生長；過低（<20 個(gè) / 孔）則因自分泌因子匱乏，類器官形成效率降低 50% 以上；

• 收獲時(shí)機(jī)影響：原代類器官的收獲時(shí)機(jī)直接影響數(shù)量達(dá)標(biāo)率，例如中 / 后腸球狀體需在分化第 5-9 天收集，過早（第 5 天）或過晚（>9 天）均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)活性下降，間接減少有效傳代數(shù)量。

3. 結(jié)構(gòu)完整性：形態(tài)學(xué)評估與傳代時(shí)機(jī)判斷

類器官的結(jié)構(gòu)特征是判斷傳代時(shí)機(jī)的直觀指標(biāo)，需通過形態(tài)學(xué)觀察與定量測量聯(lián)合判斷，確保傳代時(shí)細(xì)胞處于最佳生長狀態(tài)：

• 理想結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)：

? 形態(tài)：呈規(guī)則囊狀（如腸道類器官）、多小葉狀（如肝類器官）或分支管狀（如肺類器官），無中心暗區(qū)及壞死灶；

? 直徑：人源類器官通常為 200-500μm，鼠源類器官較小（100-200μm），超過此范圍易出現(xiàn)中心壞死；

? 生長狀態(tài)：每日直徑增幅 5-10%，培養(yǎng)基清澈（未變黃），無局部細(xì)胞死亡跡象；

• 傳代時(shí)機(jī)觸發(fā)：當(dāng)觀察到類器官生長速率減慢（直徑每日增幅 < 5%）、培養(yǎng)基 pH 下降（顏色變黃）或局部出現(xiàn)暗腔時(shí)，需立即啟動(dòng)傳代；

• 碎片大小要求：機(jī)械破碎后，需保留 > 100μm 的細(xì)胞團(tuán)碎片，此類碎片的生長率顯著高于單細(xì)胞或小碎片（<50μm），后者的類器官形成率僅 10-15%；

• 類型適配調(diào)整：不同類器官的結(jié)構(gòu)判斷標(biāo)準(zhǔn)存在差異，例如食管類器官以 “角化珠形成" 為傳代標(biāo)志（培養(yǎng) 9-14 天），腦類器官則需結(jié)合神經(jīng)球緊湊度及神經(jīng)元標(biāo)志物（如 β-III tubulin）表達(dá)綜合判斷。

三、營養(yǎng)體系優(yōu)化：為傳代提供精準(zhǔn) “能量供給"

類器官傳代效率的穩(wěn)定性高度依賴營養(yǎng)體系的精準(zhǔn)調(diào)控，需從培養(yǎng)基管理、消化液適配、添加劑優(yōu)化三個(gè)維度構(gòu)建協(xié)同體系，平衡干細(xì)胞干性維持與定向分化需求。

1. 培養(yǎng)基管理：儲(chǔ)存策略與配方適配

培養(yǎng)基是類器官傳代的 “能量核心"，其質(zhì)量控制需關(guān)注因子活性維持與個(gè)性化配方選擇：

• 儲(chǔ)存策略：

? 培養(yǎng)基（含生長因子）需 - 20℃分裝儲(chǔ)存，有效期可延長至 1 年；

? 4℃短期儲(chǔ)存需嚴(yán)格控制在 2 周內(nèi)，超過 1 個(gè)月會(huì)導(dǎo)致關(guān)鍵因子（如 Wnt3a、R-spondin-1）活性顯著下降，使類器官增殖率從 90% 降至 55%；

? 傳代后干細(xì)胞對培養(yǎng)基質(zhì)量更敏感，需絕對避免使用儲(chǔ)存過久的培養(yǎng)基；

• 配方適配：

? 腸道類器官：人源推薦使用 IntestiCult™ Organoid Growth Medium (human)，鼠源使用對應(yīng)小鼠版本，此類培養(yǎng)基通過預(yù)優(yōu)化 Wnt/R-spondin 信號(hào)軸濃度，可提升傳代后 24 小時(shí)貼壁率；

? 乳腺類器官：可測試 1 型和 2 型擴(kuò)增培養(yǎng)基，或采用自制條件培養(yǎng)基（含 R-spondin-1、Noggin 和 Wnt3a）；

? 腦腫瘤干細(xì)胞類器官：需使用 10-DPM 培養(yǎng)基，其中 4-DPM（RG108、A83-01、毛喉素、Bay K8644）為必需小分子，添加 RSPO1 的 5-DPM 配方可實(shí)現(xiàn)長期傳代；

• 操作規(guī)范：

? 商品化培養(yǎng)基（如 IntestiCult™）37℃水浴解凍后應(yīng)立即使用，禁止再次冷凍；

? 基質(zhì)膠使用濃度需 > 70%，操作全程在冰上進(jìn)行以防提前凝固；

? 換液頻率建議每 3-5 天一次，維持穩(wěn)定的營養(yǎng)微環(huán)境。

2. 消化液適配：酶組合與活性維持

消化液的選擇與管理直接影響類器官解離效率與細(xì)胞存活率，需根據(jù)組織類型匹配酶組合，并嚴(yán)格控制酶活性：

• 酶組合選擇：

? 腸道類器官：推薦使用 TrypLE™ Express，其溫和的蛋白水解活性可減少干細(xì)胞損傷；

? 胰腺類器官：需 Dispase 與 DNAse I 聯(lián)用，Dispase 分解細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，DNAse I 可降解游離 DNA，防止細(xì)胞團(tuán)聚；

? 專用消化液優(yōu)勢：針對性酶組合可使傳代后細(xì)胞存活率提升 20%，優(yōu)于通用消化液；

• 儲(chǔ)存與使用：

? 消化液需 - 20℃分裝保存以維持酶活，有效期可達(dá) 1 年；

? 4℃儲(chǔ)存建議 2 周內(nèi)用完，超過 1 個(gè)月會(huì)出現(xiàn)酶活性下降，增加過度消化風(fēng)險(xiǎn)；

? 腸道隱窩來源類器官消化后接種時(shí)，需添加抗生素（如慶大霉素終濃度 50µg/ml）抑制共生微生物污染，抗生素應(yīng)在使用前新鮮添加。

3. 添加劑優(yōu)化：難養(yǎng)類器官的存活調(diào)控

針對肝、食管等難養(yǎng)類器官，需通過精準(zhǔn)添加信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑與生長因子，提升傳代效率與細(xì)胞存活：

• 難養(yǎng)類器官適配添加劑：

? 肝類器官：推薦添加 Oncostatin M（OSM，50ng/mL），通過激活 STAT3 通路促進(jìn)肝細(xì)胞成熟與存活；或使用 Y-27632（10μM）抑制 ROCK 激酶活性，減少傳代過程中的凋亡；

? 食管類器官：Y-27632 需在接種第 0 天添加，肝類器官可在整個(gè)擴(kuò)增階段持續(xù)使用；

• 擴(kuò)張培養(yǎng)基因子組合：

? 核心成分：包含 EGF、HGF、FGF-10 等生長因子，TGFβ 抑制劑（A83-01、Noggin）及 PKA 激活劑（forskolin），兼顧增殖與干性維持；

• 階段性調(diào)整：

? 傳代起始階段：采用低 FGF2 的起始培養(yǎng)基；

? 第 4 天：換用含 GlutaMaxx 和 FBS 的 IPS 培養(yǎng)基；

? 第 6 天起：切換為 N2 神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過階段性營養(yǎng)調(diào)控實(shí)現(xiàn)定向分化；

• 試劑盒優(yōu)勢：部分專用試劑盒濟(jì)研通過優(yōu)化因子配比，可提升營養(yǎng)體系穩(wěn)定性，降低批次間差異。