細胞凋亡檢測及分子生物學(xué)檢測步驟：

1、細胞DNA 含量分布（ 由細胞DNA 降解方式檢測細胞凋亡） 

    收集已固定的單細胞懸液約 5× 105~1 × 106/ml；

    離心除去固定液， 3ml PBS 重懸細胞;

   使用低速離心機 1500rpm  離心， 5 分鐘 ，棄去 PBS；

   加 PI 染液 1ml，室溫避光 20 分鐘；

   調(diào)整細胞濃度 5× 105/ml；

   上機檢測。

2 、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡

1)      常 規(guī) 制 備 單 細 胞 懸 液 ,  用 PBS   洗 兩 次 .(  若 為 全 血 要 先 溶  血),取約 5× 106 個細胞，1500rpm 離心,棄上清,用 400μl 1 ×Binding Buffer 重懸；

2)   分成 a 、b 、c 、d 、e 五管，每管約 1× 106 個細胞

a)    陰性對照，不加任何試劑；

b)    陽性對照,加 2%多聚甲醛固定 30 分鐘,加 AnnexinV 5μl, 室溫 10min , 用 1 ×Binding Buffer 洗一次,棄上清再加 190μl  緩沖液、10μl PI 避光 15 分鐘

c)    加 10μl PI，避光孵育 15 分鐘；

d)   加 5μl AnnexinV 液，室溫避光孵育 15min；

e)    加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液，室溫避光孵育 5min；

3)   每管各加 400μl 1 ×Binding Buffer。

4)   上機檢測。

注意 a.  操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞；

b.  操作時注意避光；

c.  反應(yīng)完畢后盡快檢測，最好在一小時內(nèi)檢測。

3、用單克隆抗體 APO2.7 檢測細胞凋亡

1)   放置 0.5~1× 106 個細胞到試管中；

2)    室溫離心 200g ，6min；

3)    棄上清 ，加入 100μl 冷的（4℃ )在 PBSF 溶液中含 100µg/ml  的 digitonnin，輕輕地重懸細胞，在冰上孵育 20min；

4)   加入 2ml 冷的（4℃) PBSF 液，室溫離心 200g ，6min；

5)    棄上清， 加入 20μl PE 標記的 Apo2.7  單克隆抗體和 80μl PBSF 液，用 vortex 輕輕震蕩，室溫避光孵育 15 分鐘；

6)   加入 2ml PBSF 液，室溫離心 200g ，6min；

7)    棄上清，加入 1ml PBSF 液重懸細胞；

8)   避光保存，直到流式細胞儀檢測。

PBSF：含 2.5% FCS（v/v）和 0.01%NaN3（w/v）的 PBS。

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